谷丙转氨酶测定程序(赖氏法)
原理与意义：
谷丙转氨酶(ALT/GPT)在37℃及PH7.4条件下，作用于丙氨酸及ɑ-酮戊二酸组成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸。反应30 min后(固定时间)加入2，4－二硝基苯肼(DNPH)盐酸溶液，即中止反应，同时DNPH与酮酸中羰基加成，生成丙酮酸苯腙。苯腙在碱性条件下呈红棕色，于505 nm测定吸光值并计算酶活力。根据ALT活力的高低来反映肝脏细胞损伤的程度。
二、试剂及其配制：
1. 谷丙转氨酶基质液：4 ℃冰箱保存。
2. 2,4-二硝基苯肼(DNPH)液：室温避光保存。
3. 4 mol/LNaOH：用时加蒸馏水稀释至0.4 mol/L，室温保存。
4. 2 mol/ml丙酮酸钠标准液，室温保存。
5. 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，4 ℃冰箱保存。
三、仪器设备：
离心机、7 ml离心管、移液器、分光光度计、玻璃比色杯、水浴锅、玻璃棒、冰箱、烧杯、量筒等。
四、操作步骤：
1、血清制备：
采集全血，室温放置1～2 h，3000 r×15 min离心取上清，待测。
2、血清ALT的测定：
表1 血清ALT的测定加样顺序(ml)
测定管 对照管
血清 0.1
基质液（37 ℃已预热5 min） 0.5 0.5
混匀后，37 ℃水浴30 min
2，4－二硝基苯肼液 0.5 0.5
血清 0.1
混匀后，37 ℃水浴20 min
0.4 mol/L NaOH 5 5
混匀,室温放置5 min，505 nm波长，蒸馏水调零，测各管吸光度，测定管吸光度减去对照管吸光度的差值，查标准曲线，求得相应ALT/GPT活力单位。
五、结果计算与评价
表2 标准曲线加样顺序
0 1 2 3 4 5
0.1mol/L磷酸盐缓冲液(ml) 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
2µmol/ml丙酮酸钠标准液(ml) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
谷丙转氨酶基质液(ml) 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25
2，4－二硝基苯肼液(ml) 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
混匀后，37 ℃水浴20 min
0.4 mol/L NaOH 5 5
混匀,室温放置10 min，505 nm波长，蒸馏水调零，测各管吸光度，各管吸光度减去零管吸光度的差值为纵坐标，相应的卡门氏单位为横坐标，作坐标图。
表3 标准曲线的制作
吸光度值 0.267 0.364 0.452 0.543 0.631 0.702
绝对吸光度值 0 0.097 0.185 0.276 0.364 0.435
相当于酶活力卡门氏单位 0 28 57 97 150 200
参考值： 5～25卡门氏单位/ml.(1卡门氏单位＝0.482 IU/L,25 ℃)
ALT标准曲线图见上图
六、注意事项：
1.酶活力超过150单位时，用盐水稀释血清后重测。
2.血清ALT在室温可保存2天，在0～4 ℃可保存1周，在-25℃可保存1个月。
3.制备血清时离心速度不可过高，一般3000～4000 r×（10～15）min为宜。吸上清时不要吸到沉淀。
1.参照南京建成生物工程研究所ALT试剂盒说明书。
（吕金伟）
