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以前做冰冻切片,总是遇到问题,后来查文献,自己又做实验比较,总算找到了又快又好地办法, 拿出来和大家分享一下.
1. 取脑一定要在冰上操作,液体也一定用冷的
2. 30%蔗糖一定要充分,最好中间换液一次, 20%的可以不做
3. 沉淀后冻存,一定要快冻, 最好在干冰上操作.
4. 最重要的一点, 灌注的时候, 不要用0.1M PB, 用0.01M PBS. 以前不知道,很多书上写的都是0.1M PB,后来自己用了发现还是有洞. 为了这个,我还专门作了对照实验,结果0.01M PBS更好一些, 原因不知道为什么, 但是事实如此. (理论上高浓度液体更利于保护细胞不会因为冰冻损伤)
5. 如果做磷酸化的抗体,一定记得在灌注液里加一定的抑制剂,如NaF等.
